激光共聚焦顯微鏡技術(shù)
激光共聚焦顯微鏡技術(shù)（Confocal Lasers Scanning Miccruscope CLSM)是將顯微鏡技術(shù)與激光技術(shù)有效的結(jié)合，對(duì)具有熒光標(biāo)記的物的形態(tài)及功能，通過計(jì)算機(jī)控制可以對(duì)其單層面進(jìn)行快速掃描，也可以對(duì)多個(gè)層面進(jìn)行連續(xù)光片層掃描。逐層獲得二維光學(xué)橫斷面圖像，并可通過計(jì)算機(jī)三維重組軟件支持，獲得真三維圖像。
激光共聚焦顯微鏡匯集了激光技術(shù)、顯微鏡技術(shù)、免疫熒光技術(shù)、計(jì)算機(jī)及圖像處理技術(shù)、精密的機(jī)械技術(shù)等，高、精、尖細(xì)胞分析及工程技術(shù)于一體的新技術(shù)。使其成為形態(tài)學(xué)、分子細(xì)胞生物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、藥理學(xué)、遺傳學(xué)等領(lǐng)域中新一代強(qiáng)有力的研究工具。
我們大家知道，從人類制作的第一臺(tái)顯微鏡到現(xiàn)在以有幾百年的歷史來了，隨著人類對(duì)生命科學(xué)研究的不斷深入，各種顯微鏡應(yīng)運(yùn)而生，使得研究細(xì)胞的手段以更加精密化和多樣化。共聚焦顯微鏡的理論是在1957年Marvin Minsky提出的，但共聚焦顯微鏡作為商品推出是在20世紀(jì)80年代初期，早期的激光共聚焦顯微鏡在技術(shù)上很不完善，其應(yīng)用也受到限制。至到20世紀(jì)80年代末，光學(xué)系統(tǒng)設(shè)計(jì)不斷改進(jìn)，成像的質(zhì)量和靈敏度都有所提高，進(jìn)入90年代初，激光共聚焦顯微鏡系統(tǒng)中逐步引入混合激光和紫外激光技術(shù)。90年代末由美國(guó)Meridian公司推出的新型激光共聚焦顯微鏡系統(tǒng)，已具備完善的光學(xué)系統(tǒng)，模塊化的儀器設(shè)計(jì)，靈活的軟件和高配置的計(jì)算機(jī)硬件，從而使共聚焦顯微鏡系統(tǒng)的功能不斷升級(jí)，應(yīng)用的領(lǐng)域不斷擴(kuò)展。隨著生命科學(xué)研究的不斷深入及熒光探針技術(shù)的迅速發(fā)展，共聚焦顯微鏡將推動(dòng)生命科學(xué)研究的迅速發(fā)展，同時(shí)生命科學(xué)研究的進(jìn)展也將使激光顯微鏡技術(shù)不斷改進(jìn)和完善。
激光共聚焦顯微鏡是現(xiàn)今最為先進(jìn)的光學(xué)顯微鏡，其主要優(yōu)點(diǎn)為：以激光為光源，在相應(yīng)的熒光探針標(biāo)記后，對(duì)樣本進(jìn)行逐點(diǎn)掃描，逐層獲得二維光學(xué)橫斷面圖像，具有“細(xì)胞CT”的功能，并可通過計(jì)算機(jī)三維重建軟件支持，獲得真三維圖像，并可以任意角度旋轉(zhuǎn)，觀察細(xì)胞，組織立體形態(tài)和空間關(guān)系；可以對(duì)活細(xì)胞和組織進(jìn)行無損傷的觀察，動(dòng)態(tài)測(cè)量細(xì)胞內(nèi)的Ca離子濃度和pH值等活細(xì)胞生理信息；可對(duì)細(xì)胞膜的流動(dòng)性，細(xì)胞間通訊，細(xì)胞融合，細(xì)胞骨架彈性測(cè)量等，可用作“光刀子”完成細(xì)胞內(nèi)“外科手術(shù)”。這一技術(shù)使得對(duì)活細(xì)胞和組織進(jìn)行原位，動(dòng)態(tài)，定量的觀察和測(cè)量的夢(mèng)想成為現(xiàn)實(shí)。
第一章 光學(xué)顯微鏡顯微鏡的基本原理
我們大家知道，“工欲善其事，必先利其器”光學(xué)顯微鏡不僅是發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的必要手段，也是生命科學(xué)研究基本技術(shù)條件。
第一節(jié) 普通顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)和原理
普通顯微鏡利用光線照明，標(biāo)本中的各點(diǎn)以其光吸收（即光的振幅發(fā)生變化）的不同而在明亮的背景中成像。它是由光學(xué)系統(tǒng)；機(jī)械系統(tǒng)；光源組成。
（一）光學(xué)系統(tǒng)
1． 目鏡 它是插在目鏡筒頂部的鏡頭，由一組透鏡組成，可以使物鏡成倍地分辨、放大物像，例如10X、15X等。按照所能看到的視場(chǎng)大小，目鏡可分為視場(chǎng)較小的普通目鏡，和視場(chǎng)較大的大視場(chǎng)目鏡(或稱廣角目鏡)兩類。較高檔顯微鏡的目鏡上還裝有視度調(diào)節(jié)機(jī)構(gòu)，操作者可以方便快捷地對(duì)左右眼分別進(jìn)行視度調(diào)整；此外，在這些目鏡上可以加裝測(cè)量分劃板，測(cè)量分劃板的象總能清晰地調(diào)焦在標(biāo)本的焦面上；并且，為了防止目鏡被取走以及減少運(yùn)輸中被損壞的可能性，這些目鏡可以被鎖定。
2． 物鏡 它安裝在轉(zhuǎn)換器的孔上，也是由一組透鏡組成的，能夠把物體清晰地放大。物鏡上刻有放大倍數(shù)，主要有10X、20X、40X、60X 100X等。高倍物鏡中多采用浸液物鏡，即在物鏡的下表面和標(biāo)本片的上表面之間填充折射率為1.4左右的液體（如杉木油），它能顯著的提高顯微觀察的分辨率。
物鏡的主要參數(shù)：
放大率
放大率就是放大倍數(shù)，是指被檢驗(yàn)物體經(jīng)物鏡放大再經(jīng)目鏡放大后，人眼所看到的最終圖象的大小對(duì)原物體大小的比值。是物鏡和目鏡放大倍數(shù)的乘積。放大率也是顯微鏡的重要參數(shù)，但也不能盲目相信放大率越高越好，在選擇時(shí)應(yīng)首先考慮物鏡的數(shù)值孔徑。
數(shù)值孔徑：
數(shù)值孔徑簡(jiǎn)寫NA，數(shù)值孔徑是物鏡和聚光鏡的主要技術(shù)參數(shù)，是判斷兩者（尤其對(duì)物鏡而言）性能高低的重要標(biāo)志。其數(shù)值的大小，分別標(biāo)科在物鏡和聚光鏡的外殼上。數(shù)值孔徑（NA）是物鏡前透鏡與被檢物體之間介質(zhì)的折射率（h）和孔徑角（u）半數(shù)的正玄之乘積。用公式表示如下：NA=hsinu/2
孔徑角又稱“鏡口角”，是物鏡光軸上的物體點(diǎn)與物鏡前透鏡的有效直徑所形成的角度?？讖浇窃酱螅M(jìn)入物鏡的光通亮就越大，它與物鏡的有效直徑成正比，與焦點(diǎn)的距離成反比。顯微鏡觀察時(shí)，若想增大NA值，孔徑角是無法增大的，唯一的辦法是增大介質(zhì)的折射率h值?；谶@一原理，就產(chǎn)生了水浸系物鏡和油浸物鏡，因介質(zhì)的折射率h值大于一，NA值就能大于一。數(shù)值孔徑最大值為1.4，這個(gè)數(shù)值在理論上和技術(shù)上都達(dá)到了極限。目前，有用折射率高的溴萘作介質(zhì)，溴萘的折射率為1.66,所以NA值可大于1.4。這里必須指出，為了充分發(fā)揮物鏡數(shù)值孔徑的作用，在觀察時(shí)，聚光鏡的NA值應(yīng)等于或略大于物鏡的NA值，
數(shù)值孔徑與其他技術(shù)參數(shù)有著密切的關(guān)系，它幾乎決定和影響著其他各項(xiàng)技術(shù)參數(shù)。它與分辨率成正比，與放大率成正比，與焦深成反比，NA值增大，視場(chǎng)寬度與工作距離都會(huì)相應(yīng)地變小。
分辨率：
分辨率又稱“鑒別率”，“解像力”。是衡量顯微鏡性能的又一個(gè)重要技術(shù)參數(shù)。顯微鏡的分辨率用公式表示為：d=l/NA式中d為最小分辨距離；l為光線的波長(zhǎng)；NA為物鏡的數(shù)值孔徑?？梢娢镧R的分辨率是由物鏡的NA值與照明光源的波長(zhǎng)兩個(gè)因素決定。NA值越大，照明光線波長(zhǎng)越短，則d值越小，分辨率就越高。要提高分辨率，即減小d值，可采取以下措施
1．降低波長(zhǎng)l值，使用短波長(zhǎng)光源。
2．曾大介質(zhì)h值和提高NA值（NA=hsinu/2）。
3．增大孔徑角。
4．增加明暗反差。
焦深：
焦深為焦點(diǎn)深度的簡(jiǎn)稱，即在使用顯微鏡時(shí)，當(dāng)焦點(diǎn)對(duì)準(zhǔn)某一物體時(shí)，不僅位于該點(diǎn)平面上的各點(diǎn)都可以看清楚，而且在此平面的上下一定厚度內(nèi)，也能看得清楚，這個(gè)清楚部分的厚度就是焦深。
焦深大, 可以看到被檢物體的全層，而焦深小，則只能看到被檢物體的一薄層，焦深與其他技術(shù)參數(shù)有以下關(guān)系：
1．焦深與總放大倍數(shù)及物鏡的數(shù)值孔鏡成反比。
2．焦深大，分辨率降低。
視場(chǎng)直徑（Field of view）：
觀察顯微鏡時(shí)，所看到的明亮的原形范圍叫視場(chǎng)，它的大小，是由目鏡里的視場(chǎng)光闌決定的。視場(chǎng)直徑也稱視場(chǎng)寬度，是指在顯微鏡下看到的圓形視場(chǎng)內(nèi)所能容納被檢物體的實(shí)際范圍。視場(chǎng)直徑愈大，愈便于觀察。
1．視場(chǎng)直徑與視場(chǎng)數(shù)成正比。
2．增大物鏡的倍數(shù)，則視場(chǎng)直徑減小。因此，若在低倍鏡下可以看到被檢物體的全貌，而換成高倍物鏡，就只能看到被檢物體的很小一部份。
覆蓋差：
顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)也包括蓋玻片在內(nèi)。由于蓋玻片的厚度不標(biāo)準(zhǔn)，光線從蓋玻片進(jìn)入空氣產(chǎn)生折射后的光路發(fā)生了改變，從而產(chǎn)生了相差，這就是覆蓋差。覆蓋差的產(chǎn)生影響了顯微鏡的成響質(zhì)量。國(guó)際上規(guī)定，蓋玻片的標(biāo)準(zhǔn)厚度為0.17mm, 許可范圍在0.16—0.18mm.,在物鏡的制造上已將此厚度范圍的相差計(jì)算在內(nèi)。物鏡外殼上標(biāo)科的確0.17,即表明該物鏡要求蓋玻片的厚度。
工作距離：
工作距離也叫物距，即指物鏡前透鏡的表面到被檢物體之間的距離。鏡檢時(shí)，被檢物體應(yīng)處在物鏡的一倍至二倍焦距之間。因此，它與焦距是兩個(gè)概念，平時(shí)習(xí)慣所說的調(diào)焦，實(shí)際上是調(diào)節(jié)工作距離。在物鏡數(shù)值孔徑一定的情況下，工作距離短孔徑角則大。數(shù)值孔徑大的高倍物鏡，其工作距離小。
3．光源 ：有鹵素?zé)簟㈡u絲燈、汞燈、熒光燈、金屬鹵化物燈等。
4．聚光器： 包括聚光鏡、孔徑光闌。聚光鏡由透鏡組成，它可以集中透射過來的光線，使更多的光能集中到被觀察的部位?？讖焦怅@可控制聚光器的通光范圍，用以調(diào)節(jié)光的強(qiáng)度。
（二）機(jī)械裝置
1． 機(jī)架 顯微鏡的主體部分，包括底座和彎臂。
2． 目鏡筒 位于機(jī)架上方，靠圓形燕尾槽與機(jī)架固定，目鏡插在其上。根據(jù)有否攝像功能，可分為雙目鏡筒和三目鏡筒；根據(jù)瞳距的調(diào)節(jié)方式不同，可分為鉸鏈?zhǔn)胶推揭剖健?br />
3． 物鏡轉(zhuǎn)換器 它是一個(gè)旋轉(zhuǎn)圓盤，上有3～5個(gè)孔，分別裝有低倍或高倍物鏡鏡頭。轉(zhuǎn)動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)換器就可讓不同倍率的物鏡進(jìn)入工作光路。
4． 載物臺(tái) 是放置玻片的平臺(tái)，其中央具有通光孔。臺(tái)上有一個(gè)彈性的標(biāo)本夾，用來夾住載玻片。右下方有移動(dòng)手柄，使載物臺(tái)面可在XY雙方向進(jìn)行移動(dòng)。
5． 調(diào)焦機(jī)構(gòu) 利用調(diào)焦手輪可以驅(qū)動(dòng)調(diào)焦機(jī)構(gòu)，使載物臺(tái)作粗調(diào)和微調(diào)的升降運(yùn)動(dòng)，從而使被觀察物體對(duì)焦清晰成像。
6． 聚光器調(diào)節(jié)機(jī)構(gòu) 聚光器安裝在其上，調(diào)節(jié)螺旋可以使聚光器升降，用以調(diào)節(jié)光線的強(qiáng)弱。
第二節(jié) 光學(xué)顯微鏡的分類
光學(xué)顯微鏡有多種分類方法：
按使用目鏡的數(shù)目可分為雙目和單目顯微鏡；按圖像是否有立體感可分為立體視覺和非立體視覺顯微鏡；按觀察對(duì)像可分為生物和金相顯微鏡等；按光學(xué)原理可分為偏光、相襯和微差干涉對(duì)比顯微鏡等；
按光源類型可分為普通光、熒光、紫外光、紅外光和激光顯微鏡等；按接收器類型可分為目視、數(shù)碼（攝像）顯微鏡等。常用的顯微鏡有雙目體視顯微鏡、金相顯微鏡、偏光顯微鏡、熒光顯微鏡等。
第二章 熒光顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)和原理第一節(jié) 熒光顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)和原理
熒光顯微鏡是利用較短波長(zhǎng)的光是樣品受到激發(fā)，產(chǎn)生較長(zhǎng)波的熒光，可用來觀察和分辨樣品中產(chǎn)生熒光物質(zhì)的成分和位置。任何一種熒光物質(zhì)都有的有的吸收光譜和發(fā)射光譜，熒光發(fā)射光譜比吸收光譜的波長(zhǎng)偏長(zhǎng)波方向，但二者有部分重疊。
熒光顯微鏡是利用一個(gè)高發(fā)光效率的點(diǎn)光源，經(jīng)過濾色系統(tǒng)發(fā)出一定波長(zhǎng)的光(如紫外光365或紫藍(lán)光420)作為激發(fā)光、激發(fā)標(biāo)本內(nèi)的熒光物質(zhì)發(fā)射出各種不同顏色的熒光后，再通過物鏡和目鏡的放大進(jìn)行觀察。這樣在強(qiáng)烈的對(duì)襯背景下，即使熒光很微弱也易辨認(rèn)，敏感性高，主要用于細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能以及化學(xué)成分等的研究。熒光顯微鏡的基本構(gòu)造是由普通光學(xué)顯微鏡加上一些附件(如熒光光源 、激發(fā)濾片、雙色束分離器和阻斷濾片等)的基礎(chǔ)上組成的。熒光光源——般采用超高壓汞燈(50一200W)，它可發(fā)出各種波長(zhǎng)的光，但每種熒光物質(zhì)都有一個(gè)產(chǎn)生最強(qiáng)熒光的激發(fā)光波長(zhǎng)，所以需加用激發(fā)濾片（一般有紫外、紫色、藍(lán)色和綠色激發(fā)濾片），僅使一定波長(zhǎng)的激發(fā)光透過照射到標(biāo)本上，而將其他光都吸收掉。每種物質(zhì)被激發(fā)光照射后，在極短時(shí)間內(nèi)發(fā)射出較照射波長(zhǎng)更長(zhǎng)的可見熒光。熒光具有專一性，一般都比激發(fā)光弱，為能觀察到專一的熒光，在物鏡后面需加阻斷(或壓制)濾光片。它的作用有二：一是吸收和阻擋激發(fā)光進(jìn)入目鏡、以免于擾熒光和損傷眼睛，二是選擇并讓特異的熒光透過，表現(xiàn)出專一的熒光色彩。兩種濾光片必須選擇配合使用。
（一）光源
高壓汞燈或氙燈是常用的熒光激發(fā)光源，汞燈在366nm 、405nm、436nm、546nm、577nm處有很強(qiáng)的發(fā)射線；氙燈也在光的紫外區(qū)、可見區(qū)有較強(qiáng)的發(fā)射線。
（二）光學(xué)系統(tǒng)
（1）物鏡由于激發(fā)標(biāo)本和收集熒光都是由同一物鏡實(shí)現(xiàn)的，所以物鏡的選擇尤為重要，我們選擇的標(biāo)準(zhǔn)是能透過紫外光的特制物鏡，熒光效率與所用物鏡數(shù)值孔徑的4次方成正比，所以用數(shù)值孔徑較大浸油物鏡效果較好。
（2）目鏡熒光亮度與目鏡放大倍數(shù)的平方成反比。
（3）激發(fā)濾片放置于光源和物體之間，其作用是選擇適宜于激發(fā)欲觀察熒光物質(zhì)的波長(zhǎng)范圍。
（4）阻斷濾片采用長(zhǎng)波通濾片，即使長(zhǎng)于某波長(zhǎng)的光通過，短于某波長(zhǎng)的光不能通過，進(jìn)一步使熒光與激發(fā)光分離，已獲更純的熒光。內(nèi)阻斷鋁片以固定在內(nèi)部，外阻斷濾片可跟需要裝入或卸下。
（5）雙色反色鏡他放置方向與激發(fā)光的方向呈45°，具有一個(gè)特定波長(zhǎng)值m。波長(zhǎng)長(zhǎng)于m的光被透射，波長(zhǎng)短于m的光波被反射，所以它是初分離激發(fā)光（較短波長(zhǎng)）和發(fā)射熒光（較長(zhǎng)波長(zhǎng)）的一個(gè)重要組件。
第二節(jié) 熒光顯微鏡的分類及使用注意事項(xiàng)
（一）熒光顯微鏡一般分為透射和落射式兩種類型。
a. 透射式：激發(fā)光來自被檢物體的下方，聚光鏡為暗視野聚光鏡，使激發(fā)光不進(jìn)入物鏡，而使熒光進(jìn)入物鏡。它在低倍情況下明亮，而高倍則暗，在油浸和調(diào)中時(shí)，較難操作，尤以低倍的照明范圍難于確定，但能得到很暗的視野背景。透射式不使用于非透明的被檢物體。
b. 落射式：透射式目前幾乎被淘汰，新型的熒光顯微鏡多為落射式，光源來自被檢物體的上方，在光路中具有分光鏡，所以對(duì)透明和不透明的被檢物體都適用。由于物鏡起了聚光鏡的作用，不僅便于操作，而且從低倍到高倍，可以實(shí)現(xiàn)整個(gè)視場(chǎng)的均勻照明。
（二）熒光鏡檢術(shù)的注意事項(xiàng)
a. 激發(fā)光長(zhǎng)時(shí)間的照射，會(huì)發(fā)生熒光的衰減和淬滅現(xiàn)象，因此盡可能縮短觀察時(shí)間，暫時(shí)不觀察時(shí)，應(yīng)用擋板遮蓋激發(fā)光。
b. 作油鏡觀察時(shí)，應(yīng)用"無熒光油"。
c. 熒光幾乎都較弱，應(yīng)在較暗的室內(nèi)進(jìn)行。
d. 電源最好裝穩(wěn)壓器，否則電壓不穩(wěn)不僅會(huì)降低汞燈的壽命，也會(huì)影響鏡檢的效果。
目前許多新興生物研究領(lǐng)域應(yīng)用到熒光顯微鏡，如基因原位雜交（FISH）等等。
第三章 激光共聚焦顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)
激光共聚焦顯微鏡主要是由 激光照射系統(tǒng)（氬離子激光氣器、氦乃紅、氦乃綠激光器和聲光調(diào)節(jié)器）、顯微鏡系統(tǒng)（倒或正置熒光顯微鏡和共聚焦系統(tǒng)組成）、檢測(cè)系統(tǒng)（檢測(cè)器和檢測(cè)放大器）、X-Y平臺(tái)系統(tǒng)、Z軸步進(jìn)馬達(dá)、計(jì)算機(jī)系統(tǒng)
（一） 激光照射系統(tǒng)
激光器是一種產(chǎn)生激光束的裝置，它保證光子在其中持續(xù)震蕩、反復(fù)放大得到大量的特征相同的光子，從而產(chǎn)生持續(xù)不斷的激光束。迄今為止，在21nm～7mm范圍內(nèi)，用各種激光器可產(chǎn)生幾千個(gè)激光波長(zhǎng)，但其中只有少量譜線能夠用作共聚焦顯微鏡的光源。通常采用的激光譜線有：Ar-458nm，476nm，488nm，514nm；Kr-568nm、647nm，HeNe-543nm、633nm;Ar(UV)-351nm、364nm為紫外光線；藍(lán)紫光半導(dǎo)體激光器發(fā)出405nm的激光。作為激光光源可單獨(dú)或同時(shí)配備多個(gè)激光器，以獲得更多的激光譜線，滿足大多數(shù)常用熒光探針的需要。因此，不同的儀器激光譜線數(shù)目及功率的大小根據(jù)所配置的激光器不同而有所差異。選配合理，基本能滿足多種熒光物質(zhì)的測(cè)定。
（二） 顯微鏡系統(tǒng)
熒光顯微鏡是激光掃描共聚焦顯微鏡的一個(gè)重要組成部分。它配備兩個(gè)光源：鹵素?zé)艄庠春凸療艄庠矗饕怯糜陬A(yù)覽樣品，其中鹵素?zé)艄庠从糜趯ふ覙悠方蛊矫?、觀察樣品位置、形態(tài)和分布；汞燈用于觀察和分辨樣品中產(chǎn)生熒光物質(zhì)的成分和位置。對(duì)于光敏（例如淬滅）的樣品最好用鹵素?zé)暨M(jìn)行預(yù)覽，以減少對(duì)樣品的刺激。激光共聚焦顯微鏡系統(tǒng)所用的熒光顯微鏡大體與常規(guī)熒光顯微鏡相同，但是又有其特點(diǎn)。
（1）激光共聚焦顯微鏡系統(tǒng)中，其側(cè)面打開了一個(gè)于掃描器相連接的接口，使激光能夠由此進(jìn)入顯微鏡的物鏡照射到樣品上，并使樣品發(fā)射的螢光到達(dá)檢測(cè)器。
（2）熒光顯微鏡的載物臺(tái)上裝有微量步進(jìn)馬達(dá)，以驅(qū)動(dòng)載物臺(tái)在垂直（z軸）方向移動(dòng)，用于共聚焦顯微鏡獲取不同層面光學(xué)切片，這些光學(xué)切片是共聚焦顯微鏡獲取三維熒光圖像的基礎(chǔ)。Z軸步距的大小決定了光學(xué)切片的厚度，而z軸的步距是由實(shí)驗(yàn)者輸入相應(yīng)的指令來控制的。
（3）用高倍鏡觀察樣品尤其是進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)時(shí)，最好配備倒置顯微鏡，以便適應(yīng)多種樣品的觀察，例如Petri 皿中培養(yǎng)的細(xì)胞樣品。
（4）熒光鏡座要裝有防震動(dòng)的裝置，防止在激光掃描樣品、采集圖像過程中發(fā)生載物臺(tái)在任何方向上的移動(dòng)。
（5）裝有光路轉(zhuǎn)換裝置。預(yù)覽時(shí)使用汞燈作為激發(fā)光，樣品發(fā)射的熒光進(jìn)入目鏡或照相系統(tǒng)；正式采集共焦圖像時(shí)用激光光源激發(fā)樣品，發(fā)射的熒光進(jìn)入掃描頭中的檢測(cè)器。這兩套激發(fā)光源及發(fā)射光系統(tǒng)不能同時(shí)使用，要配備光學(xué)和機(jī)械系統(tǒng)進(jìn)行光路轉(zhuǎn)換。
（6）要配備高數(shù)值孔徑的油浸或水浸物鏡采集樣品精細(xì)機(jī)構(gòu)的圖像。顯微鏡物鏡鏡頭及光路系統(tǒng)均與掃描器光路系統(tǒng)相匹配，同時(shí)由于各種波長(zhǎng)的激發(fā)光和熒光都通過物鏡，所以物鏡要保證各波長(zhǎng)范圍內(nèi)的透光性。
(7) 汞燈光線的強(qiáng)度可調(diào)，以便根據(jù)樣品中熒光物質(zhì)的強(qiáng)弱及光敏的程度調(diào)節(jié)激發(fā)光的強(qiáng)度，保證樣品在預(yù)覽過程中的熒光強(qiáng)度不發(fā)生變化，這對(duì)于后面用共聚焦顯微鏡進(jìn)一步準(zhǔn)確定量很重要。
（8）載物臺(tái)支架和附件的配備要能適應(yīng)多種樣品器皿和測(cè)試要求。因此需要配備相應(yīng)的支架和附件。常用的樣品支架有：載玻片支架、大小Petri皿支架、大小平皿支架、控溫架CO2。通氣裝置等。
（9）熒光顯微鏡的參數(shù)要與光路系統(tǒng)。計(jì)算機(jī)控制軟件系統(tǒng)相匹配。
（三）計(jì)算機(jī)系統(tǒng)
共聚焦顯微鏡儀器的各個(gè)部分由計(jì)算機(jī)予以設(shè)置和調(diào)控，使光線精確地按照設(shè)計(jì)要求掃描樣品，多有檢測(cè)信號(hào)均可被存于多維的圖像儲(chǔ)存器內(nèi)，并對(duì)圖像資料作進(jìn)一步的加工處理。計(jì)算機(jī)還可以存儲(chǔ)測(cè)定樣品的條件，以便重復(fù)試驗(yàn)。共焦圖像文件大，每一幅單色圖像要處理256kb以上，而且每一次采集圖像，一般需要將幾幅甚至上百幅圖像作為一個(gè)文件存儲(chǔ)，因此對(duì)計(jì)算機(jī)軟件功能、運(yùn)行速度，內(nèi)存、硬盤要求很高，近幾年來計(jì)算機(jī)軟件功能日益強(qiáng)大，運(yùn)行速度快，內(nèi)存、硬盤存儲(chǔ)容量大，基本滿足了激光共聚焦顯微鏡技術(shù)的要求。
第二節(jié) 激光共聚焦顯微鏡基本原理
激光掃描共聚焦顯微鏡成像原理如圖1所示，激光器發(fā)出的激光束經(jīng)過擴(kuò)束透鏡和光束整形鏡，變成一束直徑較大的平行光束，長(zhǎng)通分色反射鏡使光束偏轉(zhuǎn)90度，經(jīng)過物鏡會(huì)聚在物鏡的焦點(diǎn)上，樣品中的熒光物質(zhì)在激光的激發(fā)下發(fā)射沿各個(gè)方向的熒光，一部分熒光經(jīng)過物鏡、長(zhǎng)通分色反射鏡、聚焦透鏡、會(huì)聚在聚焦物鏡的焦點(diǎn)處，再通過焦點(diǎn)處的針孔，由檢測(cè)器接收。
第三節(jié) 共聚焦顯微鏡系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)
可對(duì)固定或者活的細(xì)胞、組織切片進(jìn)行連續(xù)斷層掃描，獲得精細(xì)的細(xì)胞骨架、染色體、細(xì)胞器、細(xì)胞膜等系統(tǒng)的三維圖像，
高水平分辨率
普通顯微鏡 0.61λ/NA；共聚焦顯微鏡 0.55λ/NA
實(shí)時(shí)多通道熒光（熒光平衡）、透射DIC觀測(cè)
數(shù)字化圖像，可以進(jìn)行圖像處理和定量分析
離子濃度測(cè)定，即檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈉、鈣、鎂、pH等離子濃度及觀察其動(dòng)態(tài)變化
光譜功能；光誘導(dǎo)功能；熒光壽命成像功能；活體多光子顯微觀察功能。
共聚焦顯微技術(shù)應(yīng)用
細(xì)胞生物學(xué)如：細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞骨架、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、流動(dòng)性、受體、細(xì)胞器結(jié)構(gòu)和分布變化、細(xì)胞凋亡機(jī)制；各種細(xì)胞器、結(jié)構(gòu)性蛋白、DNA、RNA、酶和受體分子等細(xì)胞特異性結(jié)構(gòu)的含量、組分及分布進(jìn)行定量分析；利用特定的抗體對(duì)紫外線引起的DNA損傷進(jìn)行觀察和定量；分析正常細(xì)胞與癌細(xì)胞的細(xì)胞骨架及其與核改變之間的關(guān)系；細(xì)胞黏附行為等
生物化學(xué)如：酶、核酸、受體分析、熒光原位雜交、染色體基因定位等，利用共聚焦技術(shù)可以取代傳統(tǒng)的核酸印跡染交等技術(shù)，進(jìn)行基因的表達(dá)檢測(cè)，使基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯等檢測(cè)變的更加簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確
藥理學(xué)如：藥物對(duì)細(xì)胞的作用及其動(dòng)力學(xué)；藥物進(jìn)入細(xì)胞的動(dòng)態(tài)過程、定位分布及定量分析
生理學(xué)、發(fā)育生物學(xué)如：膜受體，離子通道，離子含量、分布與動(dòng)態(tài)變化；動(dòng)物發(fā)育以及胚胎的形成，干細(xì)胞的分化等；細(xì)胞膜電位的測(cè)量，熒光漂白后恢復(fù)（FRAP）的測(cè)量等。
遺傳學(xué)和組胚學(xué)如：細(xì)胞生長(zhǎng)、分化，細(xì)胞的三維結(jié)構(gòu)，染色體分析，基因表達(dá)，基因診斷等
神經(jīng)生物學(xué)如：神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)，神經(jīng)遞質(zhì)的成分、運(yùn)輸和傳遞
微生物學(xué)和寄生蟲學(xué)如：細(xì)菌、寄生蟲形態(tài)結(jié)構(gòu)
病理學(xué)及病理學(xué)臨床應(yīng)用如：活檢標(biāo)本的快速診斷，腫瘤診斷，自身免疫性疾病的診斷
免疫學(xué)、環(huán)境醫(yī)學(xué)和營(yíng)養(yǎng)學(xué)如：免疫熒光標(biāo)記（單標(biāo)、雙標(biāo)或三標(biāo)）的定位，細(xì)胞膜受體或抗原的分布，微絲、微管的分布，兩種以上蛋白的共存與共定位，蛋白與細(xì)胞器的共定位，動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)原位跟蹤特定蛋白在細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂、分化過程中的時(shí)空表達(dá)等